[實驗技術]細胞週期染色( propidium iodide stain)

流式細胞儀之應用

細胞週期染色(flow cytometry propidium iodide stain)

在細胞凋亡的早期，發現有染色體濃縮 (chromosome condensation)的情況，染色質會聚集成半月狀沿著核膜周圍分佈，以及出現細胞核萎縮 (pyknosis); 晚期時細胞膜皺褶、失去原有細胞骨架但胞器仍在，胞膜及胞漿保持完整，去氧核糖核酸 (DNA)會斷裂成特定大小片段 (180-200 base pair) ，以及有凋亡小體 (apoptosis bodies)的產生，最後被鄰近的細胞清除。propidium iodide是一種染劑，中文名為碘化丙啶。能夠插入DNA或RNA鹼基對中並在受到488 nm激發後放出在562-588 nm間波長的激發光，因此我們可以利用這種特性去針對那些正在凋亡或染色體受損斷裂的細胞做標定並偵測它的含量。

材料和方法
1. 待測細胞固定染色方法如下（酒精固定法及PI 染色法）：
(1) 置備懸浮細胞液，調整至濃度約5x 10^6 cells/ml。若細胞株為attached cell line，先以 Trypsin 將細胞打下，調整細胞濃度（注意trypsin 處理不可過度,細胞會破裂）。
(2) 取 1 mL 細胞液，以冰冷的 PBS buffer 清洗細胞一次，離心後，去除上清液。
(3) 以剩餘的上清液將細胞打散（必須確定細胞完全打散）。
(4) 在震盪器上（轉速不可開太快）一邊震盪一邊逐一滴入3 ml 70% 冰冷的酒精（注意觀察細胞，不要讓細胞發生凝集現象）。
(5) 置於 4度 固定至少一小時。(正常處理妥善，可以放至少兩個禮拜)
(6) 染色前，將細胞從 4 度取出，以 300g 離心5 分鐘，去除上清液。
(7) 以剩餘的上清液將細胞打散，加入 5 ml PBS buffer，靜置 3 分鐘後離心，去除上清液。
(8) 重複步驟7，以5 ml PBS buffer 再清洗細胞一次。
(9) 加入 1 ml PI/Triton X-100（終濃度 PI= 20ug/ml, Triton-X 100=0.1%, RNase A= 0.2mg/ml），均勻打散細胞(這步驟相當重要，以免上機時細胞卡管)，避光染色至少30 分鐘。
(10) 上機前打散細胞並以 35um 尼龍篩網過濾樣本。
(11) 陽性控制組（已經固定而且以PI 染色的健康細胞）
(12) 陰性控制組 (已經固定，沒有以PI染色，可以調整細胞大小聚落，並可確認是否染色成功)

儀器設定
1. 參數選擇
要選擇的參數有：FS Lin、SS Lin、FL Lin、FL Peak、Ratio（Ratio= FL Peak/ FL Lin）
2. 門檻值設定
門檻值可設在FS 或FL
3. 分析圖形
對動物細胞進行分析，先利用陽性控制組細胞調整設定及繪圖。第一張要看的圖就是FS Lin- SS Lin，先調整FS、SS 電壓及Gain 值，使細胞群落在FS Lin- SS Lin 圖形中央，圈選所要觀察的細胞群，於 FL Lin- Ratio、FL Lin- FL Peak 圖形調整FL 電壓及Gain 值設定，區分螢光來源是單顆細胞還是聚集黏在一起的細胞（與基因組及倍體數分析的方法相同）。在FL Lin- Ratio 或FL Lin- FL Peak 圈選單顆細胞，於FL Lin histogram 分析單顆細胞的螢光訊號。

參考文獻出自BACKMAN FLOW COULTER EPICS XL 使用手冊

FL1:525 nM (FITC, GFP) 綠
FL2:576 nM (PE,YFP) 黃
FL3:620 nM (ECD,PI) 橘
FL4:675 nM (PC5, 7-ADD) 紅
FL5: 755 nM (PC7, PE-CY7) 紫

PI（Propidium iodide，Sigma，MO，USA）stain之原理，為PI染劑可染雙股之核酸鏈，當其以嵌合的方式（intercalation）與雙股核酸鏈結合會產生紅色螢光（640nm），但因其也會與雙股的RNA鏈相結合，故當用於測量細胞DNA時必須將細胞內之RNA移除，可藉由加入RNase達成此目的。