[實驗技術]電穿孔轉染試驗

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電穿孔試驗事前準備事項

細胞代數：

預計轉染的Plasmids：                                                 

    個6-well tissue culture plate (每一個well放入玻片，UV 照射15 min 以上)

    個50 mL 離心管;

    個轉染cuvette   

Trypsin, D-PBS, FBS medium, 200 uL tip, 1 mL tip

電穿孔試驗(electroporation)的注意事項

1      實驗通常使用分化後5到7天的脂肪細胞，然而此時的細胞貼附力很強， 最好是trypsin方式單離細胞，次之用pipetting的方式打散細胞，但必須以輕柔的方式打散細胞，上述兩個方法可以提高取得單顆存活細胞的機會，方便後續觀察、拍照。切記不可用振搖的方式，這樣會打下整片細胞，不易轉染，也不利於後續觀察．

2      離心移除上清液後，要記得用PBS清洗，主要是將剩餘尚未單離的細胞藉由 pipetting的方式分離開，越多單顆細胞，轉染效率越好，但仍特別注意過多的 pipetting 也會促使細胞死亡，必須留意。此外，不要讓細胞撞擊試管壁，這樣容易讓細胞破裂，就無法看到完整的脂肪細胞．

3      1* 10⁷  cell number/0.5 mL PBS是建議的比率 。

4      Plasmid DNA (1-600 ug)放進cuvette後，pipetting 數十下，混合均勻，也不要花太多時間，以免細胞死亡或Plasmid DNA degradation。

5      在電刺激後，細胞要放在室溫等十分鐘(這部分我沒有作，直接插在冰上)。

6      依序加入6-well plate 中，12個小時後，換新鮮的培養基(這部分我也沒有作)。特別注意這時候的細胞貼附性非常差，所以整個動作要非常小心，不然細胞很容易漂浮起來。

7      30個小時後，可以作實驗。

下列因素會影響電穿孔效率

1.        在Ｃuvette中的細胞數量(The number of cells in the cuvette)

2.        Plasmid DNA的量 (The amount of plasmid DNA.)

3.        電穿孔的伏特數(The voltage used for electroporation.)