[實驗技術]3T3-L1脂肪細胞實驗

3T3-L1 脂肪細胞培養心得

1.細胞培養

在纖維母細胞狀態時就要細心維護
正常細胞數保持在40~50%,  80%左右就要繼代培養
此外，隨著細胞代數增多  細胞逐漸老化   能成功分化的細胞數也會越來越少
要特別注意細胞老化的現象
只要細胞有以下兩種狀態，請解凍新的細胞重新繼代培養
A. 一旦發現僅有70％的細胞成功分化，
B. 或是加入分化培養基1-2天後，培養皿邊緣的細胞容易浮起
（當然你也可以用Collagen coated plate or dish  克服這個困難，只要貴實驗室有錢）

細胞一但開始老化，Glucose uptake, GLUT4 translocation 等細胞功能性試驗就容易失敗（若是收蛋白看訊息傳遞，影響倒是不大，除非你看的是跟分化相關的訊息路徑），故請務必注意細胞老化狀態

2.Glucose uptake

目前常用的是C14葡萄糖標定法，少數開始使用非放射線葡萄糖偵測（還在測試中）。
要成功完成測試glucose uptake 實驗，主要注意的點有
A. 使用100% 分化成功的脂肪細胞
由於GLUT4 的蛋白表現會隨著分化程度而增加，若是細胞分化狀態不一 ，對胰島素或試驗藥品的刺激反應就會不佳。
B. KRP solution 配製
新鮮配製為最佳，兩個禮拜以上，需要重新確認pH值
Solution pH=7.3~7.4 為最佳 （我個人偏向pH 7.3, 因我酸民個性）
C. 其他


3. GLUT4 translocation

主要使用electroporation 將GFP-GLUT4 or myc-GLUT4-GFP 轉染入adipocytes

實驗成功的條件
A. 使用100% 分化成功的脂肪細胞  (絕對不變的原則)

B. 細胞數目與轉染的Plasmid 濃度要配合
通常是觀察單一細胞的GLUT4 translocation 表現，所以Plasmid 量只要50 ug 就足夠
大約是2-4 x 10^6 = > 50 ug plasmid DNA（100 mm dish 約8 x 10^6 cells）

C.不要拍打培養皿 讓細胞自然分離
單顆細胞越多  轉染越容易成功 若是細胞結成團狀，則轉染也容易失敗

Ｄ.4% PFA固定
4% PFA/PBS 新鮮配製，固定效果最好
切記，在室溫下不要超過 10 mins。 時間一長，細胞就破裂了，實驗結果就不好
所以固定結束後，也要快速地用PBS wash 至少三次，減少PFA 影響ˋ   

4. Lenti-virus infection