[實驗技術]免疫沉降

免疫沈澱的技巧紀錄

1.Lysis buffer 

利用RIPA buffer(細胞核內蛋白)或NP40 buffer (一般性蛋白)的改良版，根據蛋白結合力，小心選擇detergent, 要先行參考相關文獻

看實驗的目的。除了基本的蛋白酶抑制劑外，加入一些磷酸酶抑制劑如Sodium vanadate用來抑制 tyrosine protein phosphatase，Sodim fluoride用來抑制Serine/Threonine protein phosphatase

RIPA buffer的缺點是其中含有SDS，蛋白可能部分變形，蛋白間的互相作用可能也被破壞。所以用RIPA之前你需要確定你所需要的蛋白不受這些因素影響。co-IP是不能用RIPA了。

NP40 buffer不會有這種蛋白變性的問題，但是同時往往會產生很多背景信號。

NP40 buffer中NaCl的基本濃度是150mM，可以根據標的蛋白彼此間的結合力來調整

彼此間結合力太弱  可以增加NaCl的濃度(300 mM）  但這樣一來有可能增加不必要的訊號（其他的蛋白也跟著沈降下來）

2.為什麼要加EDTA和EGTA？

EDTA和EGTA都是金屬螯合劑，EDTA對Mg2+離子作用比較強，EGTA對Ca2+作用比較強，他們往往被描述為metalloprotease inhibitors，但其實他們還有另一個更重要的作用，那就是阻止Mg2+磷酸化反應和Ca2++以來去磷酸化反應。

3.用什麼緩衝液

緩衝液主要是Tris、Phosphate和HEPES，三者中緩衝能力屬Tris最差，Phosphate比較適合pH值靠近7左右的，Tris和HEPES適合靠近8左右的。Phosphate還有phosphatase inhibitor的作用。Tris差歸差，但是當buffer中要加入Ca2++和Mg2++等離子的時候，那用Tris還算合理，因為這些離子會沈澱phosphate。

4.要不要加DTT？

DTT作為還原劑，可以破壞二硫鍵。一般在裂解液中可以加1mM的DTT來防止由於細胞裂解後新暴露出來的蛋白之間產生二硫鍵。對原來就存在的二硫鍵影響好像不大。但是IP中要使用抗體IgG，IgG可是有二硫鍵呀，所以還是會擔心DTT的存在不利於IP的效果，我一般選擇不加。

5.細胞裂解和IP是否需要在4度的cold room裡面做？

在室溫做的缺點在於會產生很多不希望發生的反應，雖然我們加了很多的inhibtor，但是在室溫中有的還是會發生，你無法預測。

細胞裂解我一般室溫做，然後放到到冰上，做IP抗體和beads的孵育一般在cold room中。

6.IP  incubation 的時間

原則上 初級抗體一小時以上 

Beads （Protein G or Protein A）一小時就足夠了  

具體上還要看IP時用的抗體以及標的蛋白容不容易降解  需要自己調整到最佳狀態

不過通常過度表現的蛋白(overexpression, 1mg/mL TCL)  應該在兩個小時內（primary Ab : 1.5 h, beads 30 min）就可以結束了  時間太長  可能訊號會過強 或是雜訊變多

7.清洗的問題

清洗的目的是在不減少目標信號的同時，減少背景信號，。

A，高速離心裂解液，可以到20000g左右，離心半小時到一小時，取上清。

B，Beads Prewash : 在裂解液中加IgG和Beads，或者只加Beads，孵育半小時左右，然後離心取上清。目的是把與IgG和Beads非特異性的結合蛋白都去除。

8.結果不如預期

考慮蛋白結合是否是在特殊的環境  例如 serum free 或是特殊刺激下的結合

其次   如果是內生性蛋白  增加Total  cell lysate量來做免疫沈降是最好的解決方法  

再來   看 primary Ab 究竟結合效率好不好  如果是自製血清導致抗體結合蛋白不專一  可以考慮精製抗體

最後  就是要調整Incubation Time (Primary Ab incubation time)