[實驗技術]電穿孔轉染試驗

16:59

電穿孔試驗事前準備事項

細胞代數：

預計轉染的Plasmids：                                                 

    個6-well tissue culture plate (每一個well放入玻片，UV 照射15 min 以上)

    個50 mL 離心管;

    個轉染cuvette   

Trypsin, D-PBS, FBS medium, 200 uL tip, 1 mL tip

電穿孔試驗(electroporation)的注意事項

1      實驗通常使用分化後5到7天的脂肪細胞，然而此時的細胞貼附力很強， 最好是trypsin方式單離細胞，次之用pipetting的方式打散細胞，但必須以輕柔的方式打散細胞，上述兩個方法可以提高取得單顆存活細胞的機會，方便後續觀察、拍照。切記不可用振搖的方式，這樣會打下整片細胞，不易轉染，也不利於後續觀察．

2      離心移除上清液後，要記得用PBS清洗，主要是將剩餘尚未單離的細胞藉由 pipetting的方式分離開，越多單顆細胞，轉染效率越好，但仍特別注意過多的 pipetting 也會促使細胞死亡，必須留意。此外，不要讓細胞撞擊試管壁，這樣容易讓細胞破裂，就無法看到完整的脂肪細胞．

3      1* 10⁷  cell number/0.5 mL PBS是建議的比率 。

4      Plasmid DNA (1-600 ug)放進cuvette後，pipetting 數十下，混合均勻，也不要花太多時間，以免細胞死亡或Plasmid DNA degradation。

5      在電刺激後，細胞要放在室溫等十分鐘(這部分我沒有作，直接插在冰上)。

6      依序加入6-well plate 中，12個小時後，換新鮮的培養基(這部分我也沒有作)。特別注意這時候的細胞貼附性非常差，所以整個動作要非常小心，不然細胞很容易漂浮起來。

7      30個小時後，可以作實驗。

下列因素會影響電穿孔效率

1.        在Ｃuvette中的細胞數量(The number of cells in the cuvette)

2.        Plasmid DNA的量 (The amount of plasmid DNA.)

3.        電穿孔的伏特數(The voltage used for electroporation.)

[實驗技術]細胞培養面積

以下為常用細胞培養皿粗略培養面積

100 mm dish ＝ 58.1 cm2   1.2 x 10^5
60 mm dish = 20.8 cm2
35 mm dish =9.6 cm2

6 well- plate = 9.6 cm2 (4x 10^4)
12 well- plate = 3.8 cm2 (2x 10^ 4)
24 well- plate = 1.8 cm2  (10^4)
48 well- plate = 0.75 cm2

3t3-L1 cell 培養條件 (From ATCC culture method )

Volumes are given for a 75 cm2 flask. Increase or decrease the amount of dissociation medium needed proportionally for culture vessels of other sizes. Never allow culture to become completely confluent.

1. Remove and discard culture medium.
2. Briefly rinse the cell layer with 0.25% (w/v) Trypsin - 0.53 mM EDTA solution to remove all traces of serum that contains trypsin inhibitor.
3. Add 2.0 to 3.0 mL of Trypsin-EDTA solution to flask and observe cells under an inverted microscope until cell layer is dispersed (usually within 5 minutes).
   Note: To avoid clumping do not agitate the cells by hitting or shaking the flask while waiting for the cells to detach. Cells that are difficult to detach may be placed at 37°C to facilitate dispersal.
4. Add 6.0 to 8.0 mL of complete growth medium and aspirate cells by gently pipetting.
5. Add appropriate aliquots of the cell suspension to new culture vessels.
   The recommended inoculum is 2 to 3 X 103 cells/cm2. Subculture before cultures become 70 to 80% confluent or when cells reach 5 to 6 X104 viable cells/cm2.
6. Incubate cultures at 37°C.

Interval: Every three days

Medium Renewal: 2 to 3 times per week

動物實驗

1 小鼠尾靜脈注射  Intravenous (Tail vein) injection in mice
2 小鼠口服投予、腹腔注射 Oral administration、intraperitoneal injection in mice
3 小鼠臉頰採血Lancet, facial vein in mice
4 小鼠心臟採血Blood collection from cardiac puncture in mice
5 小鼠眼窩靜脈竇採血（需鎮定或麻醉）Blood collection from orbital sinus in mice
6 小鼠皮下、肌肉、腹腔注射Subcutaneous、intramuscular injection in mice
7 大鼠股動脈插管Femoral artery catheterization in rat

[實驗技術] 免疫螢光染色

玻片處理

將玻片放在dish上，add 1N NaOH
↓
Shaker 10min
↓
Washing 3 times by MQ buffer
↓
用酒精浸泡一下
↓
照UV

以染PPARa/STAT1為例

CON, IF, FR(0.2 μM)+IF, GW(5 μM)+IF  四組

藥品配置

1. Stock:

IFN: Take 1 μL stock dil with 14 μL 106 U/mL (1000 U/μL); 

Fluoxetine: 10 mM; 

Fludarabine 10 mM; 

5 μL(10 mM) dil with 245 μL ddH2O (5 μL x 10 mM/250 μL);

5 μL (200 μM) dil with 4995 μL culture medium (5 μL x 200 μM/5000 μL)

GW6471 10 mM

2. Final culture medium (1.5 mL)

IF   

取1.5 uL IFN + 1.5 uL Flu dil 1500 uL

FR+IF  

取 dil Fludarabine 1.5 uL for 30 min, 取1.5 uL IFN + 1.5 uL Flu dil 1500 uL

GW+IF 

取 GW 0.75 uL for 30 min, 取1.5 uL IFN + 1.5 uL Flu dil 1500 uL

1. Cover slides wiped clean with 75% ethanol and UV for 30min 要注意棉絮殘留在玻片

2. 1 cover slide for 1 well

3. seeding 2x10^4/well in 24-well; 0.5 mL/well; 37℃, overnight

4. Change medium to 1.5mL/well; add FR/GW for 0.5 hr and then add IF for 6 hr

5. 1x PBS rinse x 1 times; 500 μl/well

6. 4% paraformaldehyde 500μl /well, 20min, RT

7. 1x PBS rinse x 3 times; 500μl /well, 

8. Triton X100 0.2% in PBS, 10 minutes for nuclear protein staining; 

9. 1x TBST, wash 3min x 3 time, 70rpm; 500 μl /well

10. Primary antibodies for 6hr treatment, STAT1 (nuclear protin; mouse) and PPARa (nuclear protein; rabbit) in TBST (1:˙50) 同時加入染; 4℃, overnight; 200 μl /well

(上染劑應要慢慢染，轉數可以調慢)

11. Primary antibody for 24hr treatment, Glut2 (membrane protein; rabbit) in TBST (1:100); 4℃, overnight; 250 ul/well 1x TBST, wash 5min x 6-12 times, 70rpm; 500 μl /well (手也可以先搖一下、轉一下，清洗應要略快，轉速可以調快，不可以溢出)

12. 2°Ab (mouse, green 488 and rabbit, red 568) (1:200) in 1x TBST, 1hr, RT, 70rpm, 避光:   200 μl /well                                                             

Mouse (488) - Green (1:200) dilute 1000  =  5 μl +995 μl TBST; 

Rabbit (568) - Red 1:200 dilute1000  =  5 μl +995 μl TBST

13. DAPI in 1x TBST (1:100,000), 與 2°Ab 同時加入染 1hr, RT, 70rpm, 避光

14. 1x TBST wash 5min x 10 times, 70rpm, 500ml/well; 避光

15. 封片, 使用封片膠; 避光

16. store at 4℃/-20℃

根據11/06的結果  下列事項要進行修正

1. 紅光太強 – PPARa  一抗濃度改為 1:80

2. 綠光太弱 – STAT1 一抗濃度改為 1: 25

PPARa(1:˙80) 10 uL   STAT (1 :25) 32 uL

以TBST 758  uL 混合成 800uL  

加入細胞  反應overnight

    二抗 

同時混合二抗

Green (1:200): 4 uL

Red (1:200): 4 uL

以TBST 792 uL 混合成 800uL  (1:200)

DAPI 分開染

DAPI(1:10,000)/ 2 min

3.玻片要前處理，背景會比較乾淨

4. 所有的溶液要先以0.22 uM過濾，降低雜質的干擾

[生活態度] 低頭謙遜 埋頭苦幹

認真充實智能   努力訓練技能

不要浪費所有的時間

努力的往前看   不要放棄自己

要持續的努力   努力   不要鬆懈

態度決定一切！！！

改變   改變   改變   全力尋求改變