[實驗技術]3T3-L1脂肪細胞實驗

3T3-L1 脂肪細胞培養心得

1.細胞培養

在纖維母細胞狀態時就要細心維護
正常細胞數保持在40~50%,  80%左右就要繼代培養
此外，隨著細胞代數增多  細胞逐漸老化   能成功分化的細胞數也會越來越少
要特別注意細胞老化的現象
只要細胞有以下兩種狀態，請解凍新的細胞重新繼代培養
A. 一旦發現僅有70％的細胞成功分化，
B. 或是加入分化培養基1-2天後，培養皿邊緣的細胞容易浮起
（當然你也可以用Collagen coated plate or dish  克服這個困難，只要貴實驗室有錢）

細胞一但開始老化，Glucose uptake, GLUT4 translocation 等細胞功能性試驗就容易失敗（若是收蛋白看訊息傳遞，影響倒是不大，除非你看的是跟分化相關的訊息路徑），故請務必注意細胞老化狀態

2.Glucose uptake

目前常用的是C14葡萄糖標定法，少數開始使用非放射線葡萄糖偵測（還在測試中）。
要成功完成測試glucose uptake 實驗，主要注意的點有
A. 使用100% 分化成功的脂肪細胞
由於GLUT4 的蛋白表現會隨著分化程度而增加，若是細胞分化狀態不一 ，對胰島素或試驗藥品的刺激反應就會不佳。
B. KRP solution 配製
新鮮配製為最佳，兩個禮拜以上，需要重新確認pH值
Solution pH=7.3~7.4 為最佳 （我個人偏向pH 7.3, 因我酸民個性）
C. 其他


3. GLUT4 translocation

主要使用electroporation 將GFP-GLUT4 or myc-GLUT4-GFP 轉染入adipocytes

實驗成功的條件
A. 使用100% 分化成功的脂肪細胞  (絕對不變的原則)

B. 細胞數目與轉染的Plasmid 濃度要配合
通常是觀察單一細胞的GLUT4 translocation 表現，所以Plasmid 量只要50 ug 就足夠
大約是2-4 x 10^6 = > 50 ug plasmid DNA（100 mm dish 約8 x 10^6 cells）

C.不要拍打培養皿 讓細胞自然分離
單顆細胞越多  轉染越容易成功 若是細胞結成團狀，則轉染也容易失敗

Ｄ.4% PFA固定
4% PFA/PBS 新鮮配製，固定效果最好
切記，在室溫下不要超過 10 mins。 時間一長，細胞就破裂了，實驗結果就不好
所以固定結束後，也要快速地用PBS wash 至少三次，減少PFA 影響ˋ   

4. Lenti-virus infection

[學術研究]如何提出研究計畫

提出一個命題有時比實際進行研究和寫作還要難，因為感覺上你好像一開始就需要知道你的研究方法甚至是結論了；加上萬事起頭難的真理，研究命題往往是難以輕易跨出的第一步，更何況是腦中總擔憂提出一個不夠好的研究命題會讓你往後的步驟舉步維艱，壓力一大這命題似乎就更加難產了。



考慮研究主題之前的步驟
1. 是否熟習你的研究領域與研究進展
 >>>>  全面熟悉後，才能有足夠的能力縮小關注焦點
>>>>   挑選一組數據/方法/設備/技術來界定你的研究命題，
             然後問自己，還有什麼問題是不清楚的

不要害怕更改研究方向，因為隨時都有可能有新的數據去影響原本的假設
但你能夠輕易的回頭透過重新檢視你所選擇的這組數據/方法/設備/技術來尋找新的角度和研究方向，幾乎不可能找不到不同的角度！

所選擇的研究命題可能會在研究過程中有所改變，這是正常的，不要因此而嚇破了膽覺得肯定哪裡出錯了。因為通過嚴謹步驟而擬定的研究命題往往不會偏差到哪裡去，這個過程就是來幫助你少走彎路，更有系統的提出強大的研究命題的。

[論文寫作] 入門基礎

論文是一種八股文章  有既定的結構語法

有邏輯的論文結構，代表您的組織技巧良好，並具有研究主題領域的專業素養。

以下是研究論文寫作流程表：

1. 摘要：接近論文完成時，再回頭撰寫這個部分，有助於適當節錄整個研究內容。換句話說，這個部分就是該研究顯著性、限制、結果與結論的概要。＊摘要怎麼寫？
2. 前言：吸引讀者注意．向讀者介紹您的研究論文，告訴讀者爲什麼値得從頭閱讀到尾。前言應詳盡敘述爲什麼選擇這個題目，以及您的研究如何幫助讀者了解這個主題與其所屬領域的相關性。前言不要充斥技術性詞彙，而是善用某些詞彙來表達您的觀點即可。此外，務必引起讀者注意，才能讓他們被您的論文所吸引。
3. 文獻回顧：這個部分是「倒帶」與主題有關、過去的想法與觀念，讓讀者知道過去有哪些研究引導您選擇這個主題。分享研究主題的背景，如果這只是研究過程的一部分，必須描述從過去數年直到現在廣泛的知識。避免使用年代太久遠的文獻，因為有些假設或學說可能已經被證實不存在．
4. 論文主體：內容要詳盡。這裡您需要與讀者溝通如何、為何及什麼是您論文研究的領域。開始先詳細敘述如何進行研究，如果有實驗的部分，還要敘述實驗過程，然後得出的結果。根據您所採用的方法，可依下列想法組織研究論文的主體：
1. 理論：提及用來作為研究基礎的現有理論，或是您用來支持某些說明的理論。不管是主要還是次要理論，都要引用書寫。
2. 材料與方法：需要用到的材料，以及如何進行實驗步驟，逐步敘述得出結果的各項不同步驟。
3. 結果與討論：將您發現的結果逐一列出，但不要忘了用這些結果回頭說明假設。爲了呈現結果，可利用圖表、數據、資料等來表示。
   討論的其中一部分，是對照結果的重要性，可能有些發現與目前資料有所不同。另外，也提出相關領域是否有進一步研究的可能性。
4. 結論：乾脆並簡潔。好的結論可爲一篇好文章畫龍點睛。不需要再長篇大論「結論」您的研究論文，這些在討論的部分應該都已經完成。結論是要分享您在研究過程中遇到的限制、未來研究可能的領域、發現有問題的部分等。
5. 參考文獻：有許多不同型態編排方式，請使用最適合您研究主題的那種書寫方式。

[實驗技術]電穿孔轉染試驗

16:59

電穿孔試驗事前準備事項

細胞代數：

預計轉染的Plasmids：                                                 

    個6-well tissue culture plate (每一個well放入玻片，UV 照射15 min 以上)

    個50 mL 離心管;

    個轉染cuvette   

Trypsin, D-PBS, FBS medium, 200 uL tip, 1 mL tip

電穿孔試驗(electroporation)的注意事項

1      實驗通常使用分化後5到7天的脂肪細胞，然而此時的細胞貼附力很強， 最好是trypsin方式單離細胞，次之用pipetting的方式打散細胞，但必須以輕柔的方式打散細胞，上述兩個方法可以提高取得單顆存活細胞的機會，方便後續觀察、拍照。切記不可用振搖的方式，這樣會打下整片細胞，不易轉染，也不利於後續觀察．

2      離心移除上清液後，要記得用PBS清洗，主要是將剩餘尚未單離的細胞藉由 pipetting的方式分離開，越多單顆細胞，轉染效率越好，但仍特別注意過多的 pipetting 也會促使細胞死亡，必須留意。此外，不要讓細胞撞擊試管壁，這樣容易讓細胞破裂，就無法看到完整的脂肪細胞．

3      1* 10⁷  cell number/0.5 mL PBS是建議的比率 。

4      Plasmid DNA (1-600 ug)放進cuvette後，pipetting 數十下，混合均勻，也不要花太多時間，以免細胞死亡或Plasmid DNA degradation。

5      在電刺激後，細胞要放在室溫等十分鐘(這部分我沒有作，直接插在冰上)。

6      依序加入6-well plate 中，12個小時後，換新鮮的培養基(這部分我也沒有作)。特別注意這時候的細胞貼附性非常差，所以整個動作要非常小心，不然細胞很容易漂浮起來。

7      30個小時後，可以作實驗。

下列因素會影響電穿孔效率

1.        在Ｃuvette中的細胞數量(The number of cells in the cuvette)

2.        Plasmid DNA的量 (The amount of plasmid DNA.)

3.        電穿孔的伏特數(The voltage used for electroporation.)

[實驗技術]細胞培養面積

以下為常用細胞培養皿粗略培養面積

100 mm dish ＝ 58.1 cm2   1.2 x 10^5
60 mm dish = 20.8 cm2
35 mm dish =9.6 cm2

6 well- plate = 9.6 cm2 (4x 10^4)
12 well- plate = 3.8 cm2 (2x 10^ 4)
24 well- plate = 1.8 cm2  (10^4)
48 well- plate = 0.75 cm2

3t3-L1 cell 培養條件 (From ATCC culture method )

Volumes are given for a 75 cm2 flask. Increase or decrease the amount of dissociation medium needed proportionally for culture vessels of other sizes. Never allow culture to become completely confluent.

1. Remove and discard culture medium.
2. Briefly rinse the cell layer with 0.25% (w/v) Trypsin - 0.53 mM EDTA solution to remove all traces of serum that contains trypsin inhibitor.
3. Add 2.0 to 3.0 mL of Trypsin-EDTA solution to flask and observe cells under an inverted microscope until cell layer is dispersed (usually within 5 minutes).
   Note: To avoid clumping do not agitate the cells by hitting or shaking the flask while waiting for the cells to detach. Cells that are difficult to detach may be placed at 37°C to facilitate dispersal.
4. Add 6.0 to 8.0 mL of complete growth medium and aspirate cells by gently pipetting.
5. Add appropriate aliquots of the cell suspension to new culture vessels.
   The recommended inoculum is 2 to 3 X 103 cells/cm2. Subculture before cultures become 70 to 80% confluent or when cells reach 5 to 6 X104 viable cells/cm2.
6. Incubate cultures at 37°C.

Interval: Every three days

Medium Renewal: 2 to 3 times per week