[論文寫作] Aim, goal, purpose, end, object, objective

Ａim,goal,purpose,end,target,object,objective   這些名词均有“目標、目的”之意。

寫作時，要注意區分語意：



Aim : 表示你有計畫要完成特定目標（具體而明確的），通常是指短期目標



Goal:通常是指球賽或比賽的得分，使用時表示是經過思考跟考慮後  努ㄌ奮鬥才能達到的目標。



Purpose:通常有一個具體的理由跟原因促使你想要去完成某個目標時，會使用Purpose

例如因為觀察到某個天然物可能具有治療疾病的功效，因此你想要企圖去了解他的作用機轉  （但實際上的結果會怎樣？其實你無法預期）



End: 比較強調的是結果 而非過程



Target: 原意是只用武器攻擊的目標，文章中則常用於被攻擊或批評的對象



Objet and Objective: 比較偏重因事實或證據而設定的目標

[實驗技術]免疫沉降

免疫沈澱的技巧紀錄

1.Lysis buffer 

利用RIPA buffer(細胞核內蛋白)或NP40 buffer (一般性蛋白)的改良版，根據蛋白結合力，小心選擇detergent, 要先行參考相關文獻

看實驗的目的。除了基本的蛋白酶抑制劑外，加入一些磷酸酶抑制劑如Sodium vanadate用來抑制 tyrosine protein phosphatase，Sodim fluoride用來抑制Serine/Threonine protein phosphatase

RIPA buffer的缺點是其中含有SDS，蛋白可能部分變形，蛋白間的互相作用可能也被破壞。所以用RIPA之前你需要確定你所需要的蛋白不受這些因素影響。co-IP是不能用RIPA了。

NP40 buffer不會有這種蛋白變性的問題，但是同時往往會產生很多背景信號。

NP40 buffer中NaCl的基本濃度是150mM，可以根據標的蛋白彼此間的結合力來調整

彼此間結合力太弱  可以增加NaCl的濃度(300 mM）  但這樣一來有可能增加不必要的訊號（其他的蛋白也跟著沈降下來）

2.為什麼要加EDTA和EGTA？

EDTA和EGTA都是金屬螯合劑，EDTA對Mg2+離子作用比較強，EGTA對Ca2+作用比較強，他們往往被描述為metalloprotease inhibitors，但其實他們還有另一個更重要的作用，那就是阻止Mg2+磷酸化反應和Ca2++以來去磷酸化反應。

3.用什麼緩衝液

緩衝液主要是Tris、Phosphate和HEPES，三者中緩衝能力屬Tris最差，Phosphate比較適合pH值靠近7左右的，Tris和HEPES適合靠近8左右的。Phosphate還有phosphatase inhibitor的作用。Tris差歸差，但是當buffer中要加入Ca2++和Mg2++等離子的時候，那用Tris還算合理，因為這些離子會沈澱phosphate。

4.要不要加DTT？

DTT作為還原劑，可以破壞二硫鍵。一般在裂解液中可以加1mM的DTT來防止由於細胞裂解後新暴露出來的蛋白之間產生二硫鍵。對原來就存在的二硫鍵影響好像不大。但是IP中要使用抗體IgG，IgG可是有二硫鍵呀，所以還是會擔心DTT的存在不利於IP的效果，我一般選擇不加。

5.細胞裂解和IP是否需要在4度的cold room裡面做？

在室溫做的缺點在於會產生很多不希望發生的反應，雖然我們加了很多的inhibtor，但是在室溫中有的還是會發生，你無法預測。

細胞裂解我一般室溫做，然後放到到冰上，做IP抗體和beads的孵育一般在cold room中。

6.IP  incubation 的時間

原則上 初級抗體一小時以上 

Beads （Protein G or Protein A）一小時就足夠了  

具體上還要看IP時用的抗體以及標的蛋白容不容易降解  需要自己調整到最佳狀態

不過通常過度表現的蛋白(overexpression, 1mg/mL TCL)  應該在兩個小時內（primary Ab : 1.5 h, beads 30 min）就可以結束了  時間太長  可能訊號會過強 或是雜訊變多

7.清洗的問題

清洗的目的是在不減少目標信號的同時，減少背景信號，。

A，高速離心裂解液，可以到20000g左右，離心半小時到一小時，取上清。

B，Beads Prewash : 在裂解液中加IgG和Beads，或者只加Beads，孵育半小時左右，然後離心取上清。目的是把與IgG和Beads非特異性的結合蛋白都去除。

8.結果不如預期

考慮蛋白結合是否是在特殊的環境  例如 serum free 或是特殊刺激下的結合

其次   如果是內生性蛋白  增加Total  cell lysate量來做免疫沈降是最好的解決方法  

再來   看 primary Ab 究竟結合效率好不好  如果是自製血清導致抗體結合蛋白不專一  可以考慮精製抗體

最後  就是要調整Incubation Time (Primary Ab incubation time)

[實驗技術] 油紅實驗 （Oil red O staining）

Oil red O staining （12 well -scale, Collagen coated plate）

Preparation

1.   99% isopropanol and 60% isopropanol

2.   Sterilised PBS buffer 500 mL

3.  4% paraformaldehyde (PFA) in PBS buffer, pH 7.4 (FRESH MADE)

4.   Oil red O solution

A.       (Stock): 300 mg oil red O powder in 100 mL 99% isopropanol 

        ( stable for one year ) >>>3 mg/mL

B.       (Working): 30 mL stock Oil red o solution: 20 mL deionized water (DW)

(stable for only for two hours, FRESH MADE) >>> Final conc.1.8 mg/mL 

Process

1.    PBS 1 mL/ well wash x 2, washing gently and voiding the cell floating.

2.    Aspirate the PBS

3.    Add 4% PFA 1 mL/ well, incubation at room temperature for 1 hour

4.    Transfer PFA to PFA waste bottle

5.    Add PBS 1 mL/well x 1

6.    Add 60% isopropanol 1 mL/well for 10 mins

7.    Aspirate 60% isopropanol

8.    Add Oil red O working solution 1 mL/ well, and incubation for 10 min (If it is possible, put the plate on the Microplate shaker, slowly)

9.    Aspirate Oil red O working solution, and wash with PBS x1 or until the waste is clear

10. Elute Oil red O by adding 100 % isopropanol 1 mL/well

11. Incubation for 30 min at room temperature

12.Transfer 200 uL of each well to 96 well plate for analysis

13. Measure OD at 500 nm ( Blank: 100 % isopropanol) 

[實驗技術 ] PEG濃縮法 （Lentivirus 非超高速離心法）

PEG 濃縮法 (up t0 10 ~100 folds)

5x PEG8000 solutions (50 g PEG 8000/ 8.733 g NaCl in 200 mL MQ)

1. Transfer supernatant to a sterile vessel and add 1 volume of cold PEG-it Virus Precipitation Solution (4ºC) to every 4 volumes of Lentivector-containing supernatant. (Example: 5ml PEG-it with 20ml viral supernatant).

*100 mm dish= 10 mL

2. Refrigerate overnight (4ºC, at least 12 hours). Lentivectorcontaining supernatants mixed with PEG-it Virus Precipitation Solution are stable for up to 4-5 days at 4°C.

3. Centrifuge supernatant/PEG-it mixture at 1500 × g for 30 minutes at 4ºC. After centrifugation, the Lentivector particles may appear as a beige or white pellet at the bottom of the vessel.
4. Transfer supernatant to a fresh tube. Spin down residual PEGit solution by centrifugation at 1500 × g for 5 minutes. Remove all traces of fluid by aspiration, taking great care not to disturb the precipitated Lentiviral particles in pellet.

5. Resuspend/ combine lentiviral pellets in 1/10 to 1/100 of original volume using cold, sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) or DMEM containing 25mM HEPES buffer at 4ºC.
(Example: 20ml viral supernatant-->2 mL or 200 uL).

6. Aliquot into cryogenic vials and store at -70°C until ready for use.

[實驗技術]PEI 細胞轉染

Polyethylenimine(PEI)轉染(Transfection)實驗

原理:
Polyethylenimine(PEI)為一個帶正電的分子，而他會以包覆的形式和DNA形成一個複合物，並且將欲送入的DNA送到細胞內表現。

60 mm dish scale (HEK 293T cells)

Day 0 晚上  細胞播種  3-4 x 10^5 cell/ dish （ 12 小時後 約80%滿）
Day 1 早上  準備轉染的Plasmid

材料 （per dish）：
Plasmid DNA 4 ug,
PEI 4 uL,
OPTI-MEM (or serum free medium) 400 uL
Mix well （ 10-15 sec x2 vortex)
靜置15 mins,
在靜置的時間內，更新細胞培養基（4 mL/dish）
以放射狀的方式，緩慢地將混合液加入細胞中，盡量避免傷害細胞
6小時後再次更換新的培養基 （觀察細胞狀態  若死細胞不多  可以隔天再換）

Day 2 Post-transfection for 24 hours (若轉染DNA載有GFP等螢光Taq, 應該可以看見      GFP訊號)
Day 3 Post-tranfection for 48 hours,
原則上轉染後，在30-48小時內表現量最大
基本上  在293T cells這類容易易轉染的細胞 約80%以上細胞有螢光訊號  轉染才算成功
若是FLAG, MYC 等非螢光蛋白  可進行西方點墨法 確認標的蛋白是否過度表現(overexpression)